Merk: Følgende artikkel er inkludert under andre konvensjonelle terapier fordi en egen seksjon ennå ikke er tilgjengelig for eksperimentelle molekylærbiologiske metoder utenfor humanmedisin. CRISPR / Cas-metoden er en molekylærbiologisk metode for målrettet kutting samt modifisering av DNA (genomredigering; gen saks). I 1987 oppdaget forskere en tidligere ikke-observert adaptiv immunsystem i E. coli. Dette er basert på såkalte CRPSPR-sekvenser (klynget regelmessig innbyrdes korte palindromiske gjentakelser) innenfor DNA. E. coli integrerer DNA fra bakteriofager (grupper av virus som spesialiserer seg på bakterie som vertsceller) CRSPR-sekvensen av sitt eget DNA, og transkriberer dermed et crRNA (omskriver DNA til RNA). CrRNA består av både avstandsstykke og gjentatte sekvenser. Avstandssekvenser er sekvensene "ekstrahert" fra bakterie. Den såkalte trRNA (tracrRNA) binder seg til navngitte gjentakelsessekvenser. Den rekrutterer CAS9-enzymet. Et kompleks er nå til stede - crRNA: tracrRNA: Cas9-komplekset - som er i stand til å binde bakteriofag-DNA som er komplementært til romsekvensene til crRNA. Som en såkalt endonuklease (DNA-skjærende enzym, dermed et restriksjonsenzym), kutter CAS9 viralt DNA på en dobbeltstrenget måte, noe som til slutt fører til manglende replikasjonsevne (dvs. ingen ytterligere replikering og følgelig ingen videre integrasjon). I mer enn et tiår har denne prosedyren blitt brukt med vekt i genomredigeringsforskning. Beskrevet “crRNA: tracrRNA: Cas9-kompleks” er universelt anvendelig for planter og dyr og tillater fjerning (sletting) og endelig demping av gener. En bruk utenfor forskning har blitt funnet i mer enn 5 år i jordbruk og matavlinger for tørke toleranse samt immunisering forbedring mot virale patogener. Prosedyren kan muligens brukes i humanmedisin senere. Siden 2020 er det for første gang en kurativ terapeutisk tilnærming for en sykdom med medfødt hjerte defekt (vitium) hos barn. Vitium er en del av den komplekse arvelige sykdommen Noonan syndrom (autosomal recessiv eller autosomal dominerende arv). Etter å ha dekryptert årsaksvariantene til LZTR1 gen, passende genkorreksjon av de genererte induserte pluripotente kardiomyocytter (hjerte muskelceller) fra stamcellene til tvillingene ble utført. De gen regulerer viktige signalveier for celledifferensiering og vekst.
Før denne potensielle behandlingen i humanmedisin
Molekylær genetisk testing for arvelige lidelser hos foreldre, inkludert omfattende genetisk rådgivning.
Fremgangsmåten
Fremgangsmåten er lik den for forsvarsmekanismen til E. coli beskrevet i immunsystem. I denne prosessen kan avstandsdelen av crRNA modifiseres for å kutte sekvensspesifikk dobbeltstrenget komplementært DNA, noe som resulterer i målrettede slettinger. Det kjemisk modifiserte trRNA: crRNA-molekylet kalles guideRNA. Dette krever to forskjellige crRNA: tracrRNA: Cas9-komplekser for å feste seg til to steder på DNA. Etter fjerning av DNA-fragmentet, oppstår enzymassistert kobling av de andre DNA-fragmentene av ligaser. Dette skiller seg fra bare kutting av en DNA-sekvens som i bakterien. Gjennom årene har viktige modelleringsteknikker blitt lagt til. Disse tillater ikke bare sletting i DNA-strengen, men også tilsetning (innsetting) av nye DNA-nukleotider. Den mest lovende modifikasjonen er primærredigering. Her blir en sletting og dermed fjerning av et DNA-fragment fulgt av innsetting av et nytt DNA-fragment. Den såkalte pegRNA (primærredigeringsguide RNA) er tilgjengelig her som transkripsjon av DNA som skal settes inn. Ved hjelp av en omvendt transkriptase blir pegRNA transkribert i DNA og innlemmet i DNA, igjen ved bruk av ligaser. CAS2-proteinet som kreves for denne prosessen, genererer enkeltstrengede i stedet for dobbeltstrengede kutt. Dette gjør at det nye DNA-fragmentet kan settes inn med en presis passform i den kutte DNA-strengen med sine utstikkende ender. Den nye modifikasjonen er grunnleggende for å utveksle den "patologiske" DNA-sekvensen i henhold til den "ikke-patologiske" i fremtiden i sammenheng med en arvelig sykdom.
Etter behandling
Nok en gang utføres genomscreening for å bekrefte suksessen med genomredigering.
Mulige komplikasjoner
På grunn av mulige basemisparinger av guideRNA, kan effekter utenfor målet, dvs. binding på det uønskede stedet, forekomme. Disse kan forårsake punktmutasjoner (baseendringer), innsettinger (inkorporering av ytterligere nukleotider eller DNA-sekvenser i en DNA-sekvens), slettinger (tap av ...), translokasjoner (endring i DNA-posisjon) og inversjoner (tilstedeværelse av et DNA-segment slått 180 grader). CAS9-enzymet kutter ikke i hvert tilfelle på ønsket sted. Imidlertid har økninger i spesifisitet allerede blitt realisert gjennom endringer i proteindesign. Også ved å koble CAS9 til en endonuklease Fokl, også avledet fra bakterie, kunne spesifisitet økes til 1: 10,000 (uten andre modifikasjoner, bare spesifisitet på opptil 1: 2).
