Klinisk alene, altså på grunnlag av syfilis symptomer, kan diagnosen ikke stilles, siden syfilis symptomer kan variere sterkt og er ikke spesifikke. Derfor en mikroskopisk og serologisk syfilis testen må utføres. Det er ikke mulig å dyrke bakterien T. pallidum på et dyrkningsmedium. I den mikroskopiske diagnosen av syfilis test, blir det tatt utstryk fra huden og slimhinneforandringene og den oppnådde sekresjonen undersøkes under et mørkt feltmikroskop. Under et vanlig lysmikroskop bakterie kan ikke oppdages fordi de er for tynne. I tillegg til den typiske strukturen, liten diameter, jevne spoler, rask bøying og stretching bevegelse midt i bakteriekroppen er karakteristisk. Et positivt testresultat er bevis på sykdommen, men et negativt resultat ekskluderer ikke syfilis. I serologisk diagnostikk utføres antistoffscreeningstester som er positive 2-4 uker etter infeksjon. antistoffer blir oppdaget som har dannet seg mot antigener på overflaten av det patogene bakterie. TPHA-testen (T. pallidum hemagglutination test, i dag også kalt TPPA-test) er en sensitiv og svært spesifikk søkereaksjon der antistoffer mot T. pallidum klump (agglutinat) rød blod celler (erytrocytter) lastet med T. pallidum antigen. Det blir positivt i 2. uke etter infeksjon med syfilis og forblir det i mange år etter at sykdommen er grodd (“seronar”). Tidlig i primærfasen kan det fortsatt være negativt. Testen brukes i tilfeller av mistanke om syfilis, men også for rutinemessig screening i Tidlig graviditet, Av blod givere og blodkonserver. Positive resultater krever en bekreftelsestest: I FTA-ABS-testen (Fluorescence Treponema Antibody Absorption Test) bakterie er festet på et lysbilde og ført sammen med blod serum, den flytende delen av blodet. De antistoffer i blodserumet festes deretter til antigenene til bakteriene. Etter skylling av serumet blir antistoffene igjen merket med andre antistoffer som bærer et fluorescerende fargestoff. Under fluorescensmikroskopet blir dermed antistoffene som er søkt mot bakteriene synlige. FTA-ABS-testen, som TPPH-testen, er positiv i 2. uke etter infeksjon og forblir positiv i betydningen av et seron arr år etter klinisk helbredelse. VDRL-testen (Venereal Disease Laboratory Test), også kjent som kardiolipin-flokkuleringstest, brukes til terapi og fremgang overvåking. Denne syfilis-testen brukes til påvisning av lipidspesifikke antistoffer, som trekker seg tilbake når hudens manifestasjoner leges. Cardiolipin er et antigen ekstrahert fra hjerte av storfe og bundet til kolesterol partikler. De belastede partiklene bringes sammen med pasientens serum. I det positive tilfellet oppstår flokkulering (agglutinasjon). Denne testen blir positiv 4-6 uker etter infeksjon eller 1-3 uker etter at den primære effekten oppstår. Mengden lipidspesifikke antistoffer avtar raskt når de ytre symptomene på syfilis gro og ikke lenger er tilstede etter vellykket behandling. Denne mengden (titer) kan brukes til å vurdere om behandlingen var vellykket eller om syfilis ble utilstrekkelig behandlet. Imidlertid kan VDRL-testen også være positiv for andre sykdommer, så den er karakteristisk for, men ikke spesifikk for, syfilis. En CSF-test er utført for å bekrefte nevrosyfilis hos pasienter med nevrologiske symptomer på syfilis og for å oppdage eller ekskludere asymptomatisk nevrosyfilis. Bare antistoffer i CSF som også er produsert i CNS, viser neurosyfilis, men ikke antistoffer som har migrert fra serum til CSF. Dette kan bestemmes ved å sammenligne titrene til antistoffer i CSF og serum. Hvis forholdet mellom CSF-titer og serumtiter overstiger 2, mistenkes nevrosyfilis. Syfilis kan manifestere seg på mange forskjellige måter, spesielt symptomer på huden kan være veldig annerledes: “Syfilis er apen blant hudsykdommer”, dvs. den kan forfalske nesten hvilken som helst hudsykdom. Noen ganger forveksles Roseola syphilitica med legemiddeleksantem, som er resultatet av narkotikaintoleranse. Det smertefulle magesår molle, forårsaket av bakterien H. ducreyi, og annet hudforandringer forårsaket av infeksjoner (f.eks granulomer venerum) må skilles fra magesår durum.
