Polymerasekjedereaksjonen representerer en prosedyre fra molekylærbiologi som dupliserer seksjoner fra genetisk materiale (deoksyribonukleinsyre, DNA). Millioner av identiske kopier er produsert fra små mengder DNA. På denne måten er det tilgjengelige mengder som er tilstrekkelig for ulike undersøkelser.
Hva er polymerasekjedereaksjonen?
Polymerasekjedereaksjonen representerer en metode fra molekylærbiologi som dupliserer seksjoner fra genetisk materiale (deoksyribonukleinsyre, DNA). Begrepet polymerasekjedereaksjon (PCR) beskriver in vitro (latin: i glasset) reaksjonen ved hjelp av et enzym, polymerasen (DNA-polymerase), som fører til duplisering av visse gen sekvenser. Produktet av reaksjonen er også utgangsmaterialet for en ny syklus av denne reaksjonen. Antall molekyler dobler og fungerer samtidig som mal for en ny syklus. Dette blir referert til som eksponentiell multiplikasjon. Det foregår i laboratoriet med en hastighet på noen minutter, i likhet med en kjedereaksjon. Denne laboratorieprosessen etterligner duplisering av genetisk informasjon (DNA) som oppstår under naturlige forhold under replikasjon. Den amerikanske kjemikeren KB Mullis regnes som oppdageren av denne prosessen. I 1983 introduserte han denne DNA-synteseprosessen og ble ti år senere tildelt Nobelprisen i kjemi.
Funksjon, effekt og mål
I levende organismer, DNA i kromosomer har en lengde som ikke kan forsterkes ved hjelp av PCR. I stedet brukes den for å forsterke en definert seksjon. Dette kan være gener, en bestemt del av en gen, eller regioner som ikke er transkribert til proteiner, dvs. er ikke-kodende. Disse seksjonene består vanligvis ikke av mer enn tre tusen basepar, sammenlignet med omtrent to milliarder basepar per sett med kromosomer hos mennesker. Polymerasekjedereaksjonen krever en enkelt- eller dobbeltstrenget DNA-kjede hvis struktur må være i det minste delvis kjent. I tillegg til enzymet, polymerase, brukes to primere. Dette er byggesteiner for DNA som fungerer som start- og sluttpunkt. De er preget av en sekvens som nøyaktig samsvarer med regionen som skal forsterkes. I laboratoriet utføres polymerasekjedereaksjonen i en programmerbar varmeblokk. De nødvendige komponentene som polymerase, primer, byggesteinene for å bygge den nye strengen (deoksyribonukleosidtrifosfater) og magnesium ioner tilsettes i en bufferløsning. Temperatur-tidsprogrammet for reaksjonen starter med denaturering ved en temperatur over 94 ° C. I denne prosessen spaltes det dobbeltstrengede DNA og er tilstede i enkelstrenget form. I neste trinn, ved ca. 70 ° C, er primeren bundet til gen sekvens og danner utgangspunkt for enzymreaksjonen. Herfra syntetiserer polymerasen den komplementære strengen. En ny syklus begynner, og består igjen av de tre trinnene denaturering, primerbinding og syntese av DNA-strengen. Polymerasekjedereaksjonen brukes i rettsmedisin, klinisk diagnostikk og klinisk forskning. I rettsvitenskap hentes DNA fra hud, spytt, hår, sæd eller blod fra åstedet og, etter forsterkning, sammenlignet med kjente prøver og brukt til å identifisere spesifikke individer. Ved å bruke dette genetiske fingeravtrykket kan farskap også avklares i en modifisert tilnærming. Ved klargjøring av sykdommer brukes polymerasekjedereaksjonen for å verifisere de involverte genene. Noen bakterielle sykdommer kan klassifiseres ved å gjenkjenne spesifikke sekvenser. Virussykdommer kan karakteriseres når viralt DNA eller RNA transformeres og amplifiseres. I blod screening er det mulig å oppdage hepatitt eller HIV-medierte sykdommer på et veldig tidlig stadium. I tumordiagnostikk brukes den til å identifisere tumorceller. Dette gjør det mulig å klassifisere svulsten, vurdere sykdomsforløpet, suksessen til terapi og prognosen. I forskning brukes polymerasekjedereaksjonen for å identifisere gener assosiert med forskjellige sykdommer. For genkloning, som ikke er det samme som kloning av en organisme, amplifiseres genet før det overføres til andre organismer i en vektor (latin: reisende, bærer ). Disse kan fungere som modeller for bedre å studere sykdom eller å produsere proteiner som kan brukes som narkotika.
Risiko og farer
Polymerasekjedereaksjonen har stort potensiale for å oppdage små mengder DNA. For å utnytte mange muligheter og for å beskytte mot betydningsfulle feil, må visse forutsetninger og ulike feilkilder tas i betraktning. Bare seksjoner av det genetiske materialet hvis sekvens er i det minste delvis kjent, kan amplifiseres. Helt ukjente sekvenser kan ikke forsterkes ved denne metoden. Produktene fra en forsterkning kan visualiseres etterpå. Hvis det forventede signalet ikke er synlig, selv om den søkte sekvensen var til stede, er det et falskt negativt resultat. Oftest er dette resultatet av ikke-optimaliserte eller dårlig optimaliserte reaksjonsforhold. Disse må bestemmes som en funksjon av målsekvensen. For dette formål testes forskjellige temperatur- og tidsprofiler, primersekvenser og mengder samt konsentrasjoner av andre stoffer i reaksjonsblandingen. Falske positive resultater vises som signaler som ikke kan tildeles det ønskede produktet. Store problemer er forårsaket av forurensning med DNA som kommer fra etterforskeren eller fra en annen kilde enn den som skal analyseres. DNA av bakteriell opprinnelse påvirker også resultatet av en polymerasekjedereaksjon. Ved å bruke hansker og ta stor forsiktighet kan slike feil forhindres og pålitelige konklusjoner om de forsterkede produktene kan formuleres.
