In situ hybridisering er en metode for å oppdage kromosomale avvik. Det innebærer merking spesifikk kromosomer med blomstrende fargestoffer og binder dem til en DNA-probe. Denne teknikken brukes til prenatal diagnose av genetiske mutasjoner.
Hva er in situ hybridisering?
In situ hybridisering innebærer merking spesifikk kromosomer med blomstrende fargestoffer og binder dem til en DNA-probe. Denne teknikken brukes til prenatal diagnose av gen mutasjoner. In situ hybridisering eller fluorescens in situ hybridisering innebærer molekylær genetisk påvisning av nukleinsyrer fra RNA eller DNA i spesifikt vev eller en celle. Normalt brukes denne typen diagnostikk til å oppdage en strukturell eller numerisk kromosomavvik i graviditet. For dette formål brukes en kunstig produsert sonde, som i seg selv består av nukleinsyre. Det binder seg deretter til nukleinsyrer i organismen ved baseparring. Denne bindingen er referert til med begrepet hybridisering. Påvisningen utføres på pasientens levende struktur og tilsvarer derfor in situ deteksjon. For å skille seg fra dette er in vitro-metoder, hvor påvisningen foregår i reagensrøret. Metoden ble utviklet på 20-tallet av forskerne Joe Gall og Mary Lou Pardue. Teknikken har utviklet seg siden den gang. For eksempel, mens radioaktive prober ble brukt da, ble fluorescens-merkede prober med en kovalent binding til merkingen molekyler brukes i dag.
Funksjon, effekt og mål
In situ-hybridisering brukes vanligvis til å oppdage kromosomavvik, kromosomavvik som ikke kan oppdages i et karyogram. Dermed brukes metoden alltid når arvelige sykdommer skal bestemmes i løpet av graviditet. Siden kromosomavvik er et problem som ikke bør undervurderes i dag, har anvendelsen av metoden økt over tid. Hybridisering utføres ved hjelp av native celler fra moderens fostervann. Grunnlaget for teknikken er bindingen av den fargemerkede sonden til DNA-fragmenter. Takket være bindingen kan et mikroskop senere brukes til å evaluere antall kopier, ettersom de enkelte kopiene avgir et lyssignal og dermed kan synliggjøres under mikroskopet. Det er forskjellige prosedyrer for dette. Enten foregår analysen umiddelbart etter binding. I dette tilfellet et blomstringsfargestoff som biotin brukes, som er bundet direkte til DNA-sonden. I den indirekte metoden for in situ hybridisering kan ikke analysen utføres umiddelbart etter hybridisering fordi fluorescerende stoffer bare kan binde seg til sonden etter hybridisering. Denne indirekte metoden brukes oftere enn den direkte metoden fordi den anses som mer følsom. Teknikker inkluderer kromosomspesifikke sentrometer-DNA-sonder, lokusspesifikke DNA-sonder, kromosomspesifikke DNA-biblioteksonder og sammenlignende genomhybridiseringer. Kromosomspesifikke sentromere-DNA-prober kan brukes til å oppdage kromosomale numeriske abnormiteter. Det vil si at de primært brukes når de dupliseres eller slettes kromosomer mistenkes. De locusspesifikke DNA-probene er hovedsakelig egnet for påvisning av minimale mutasjoner som ikke kan oppdages i karyogrammet. En kromosomspesifikk DNA-biblioteksonde brukes spesielt til å oppdage innsettinger og translokasjoner. Sammenlignende genomhybridisering er derimot en omfattende analyse av tap og gevinster i kromosomalt materiale. I dag er in situ hybridisering av stor betydning innen diagnostikk av forskjellige kromosomale mutasjoner. I diagnostikken til Down syndromfor eksempel binder prober seg til kromosom 21. For dette formål brukes vanligvis kromosomspesifikke prober, som kan brukes i tilfeller av mistanke om denne sykdommen. En mistanke kan for eksempel oppstå hvis foreldrene tidligere har født et barn med sykdommen og ultralyd bildet er iøynefallende. Hvis det er et trippel i stedet for et dobbelt slips, noe som resulterer i et tredobbelt fargesignal, anses diagnosen som bekreftet.
Risiko, bivirkninger og farer
I motsetning til for eksempel PCR, er in situ hybridisering mye mindre utsatt for forurensning. I tillegg er tiden som kreves for prosedyren umåtelig kortere. Imidlertid, fordi embryoer spesielt danner kromosomale mønstre, kan ethvert mønster som er til stede ikke brukes til å utlede med sikkerhet resten av kromosomal distribusjon og dermed den genetiske statusen til andre celler. Fargesignaler kan også overlappe eller forbli usynlige av andre årsaker. Dermed in situ hybridisering som et diagnostisk verktøy under graviditet er relativt utsatt for feil. Feildiagnoser kan forekomme, og foreldre kan bestemme seg mot en sunn embryo. For å redusere feil-tilbøyeligheten ved in situ hybridisering, bør minst to embryonale celler undersøkes samtidig. Ved å undersøke to celler parallelt, er det nå bare en ubetydelig risiko for feildiagnostisering. Foreldre kan derfor stole på diagnosen i et slikt tilfelle. In situ hybridisering tilbys ikke alle gravide, men bare kvinner fra en risikogruppe. Likevel nektes gravide kvinner ikke denne typen diagnose etter eget ønske. Unormal ultralyd funn eller unormalt serum kan be en lege om å tilby diagnostisk prosedyre. I dag kan in situ hybridisering brukes til å diagnostisere en stor andel av kromosomavvik, men på ingen måte alle. Derfor må in situ hybridisering aldri utføres alene, men må alltid brukes i forbindelse med en konvensjonell kromosomtest. Omsorg for den gravide spiller en viktig rolle i denne prosedyren. Derfor, før analysen, foregår en grundig diskusjon om diagnostisk metode med den forventede moren, og informerer henne om risikoen, mulighetene og begrensningene ved teknikken.
