Patch-clamp teknikk er navnet på en elektrofysiologisk måleteknikk. Det gjør det mulig å måle ioniske strømmer gjennom individuelle kanaler i en plasmamembran.
Hva er patch-clamp teknikken?
Patch clamp teknikken eller patch clamp metoden tilhører elektrofysiologi, som er en gren av nevrofysiologi som håndterer den elektrokjemiske overføringen av signaler i nervesystemet. Ved hjelp av denne metoden er det mulig å visualisere individuelle ionekanaler i cellemembran av en kroppscelle. Dette innebærer måling av strømmen til noen få picoamperes. Patch-clamp-teknikken ble først beskrevet i 1976 av den tyske biofysikeren Erwin Neher og den tyske legen Bert Sakmann. De to forskerne ble tildelt Nobelprisen i fysiologi eller medisin i 1991 for utvikling av clamp-patch-teknikken. Dermed ble elektrofysiologisk forskning praktisk talt revolusjonert av patch-clamp-teknikken fordi den åpnet muligheten for å observere elektrisk oppførsel ved membranen proteiner av individ molekyler. Begrepet patch kommer fra engelsk og betyr "patch". Det refererer til en liten membransnitt under patchpipetten, som brukes som måleelektrode. Under måleprosessen er membranplasteret festet eller fastspent (for å klemme) til spesifiserte potensialer.
Funksjon, effekt og mål
Patch-clamp teknikken er en elektrofysiologisk analysemetode. Det er basert på det biologiske faktum at celler har et stort antall porer og ionekanaler. Ulike ionkonsentrasjoner eller ladninger forekommer i og utenfor hver celle, noe som avhenger av cellens fysiologiske tilstand. Lipid-dobbeltlaget i membranen er ikke gjennomtrengelig for Vann molekyler så vel som ioner. Likevel skjer en utveksling av ladede partikler over cellemembran med uregelmessige intervaller. Årsaken til dette er ionekanalens spenningsavhengighet. Hvis et visst membranpotensial er nådd, åpnes kanalene i henhold til prinsippet om "alt eller ingenting". Dette er nøyaktig hvor patchklemmeteknikken kommer inn. På denne måten føres en målepipette frem til en ionekanal uten å trenge inn i cellemembran. På denne måten kan det lokale elektriske potensialet bestemmes nøyaktig. Lekkasjestrømmer, som kan påvirke resultatet av målingen, kan vanligvis unngås ved elektrisk ekstremt tette forbindelser mellom pipettekanten og cellemembranen. Patch clamp-metoden er basert på spenningsklemmeteknikken. Denne teknikken ble utviklet på 1930-tallet av den amerikanske biofysikeren Kenneth Stewart Cole (1900-1984) for å måle strømmer på nerveceller som er intakte. I spenningsklemmen skjer innsettingen av to elektroder i en celle for å gi en kommando eller holdespenning. Samtidig brukes en annen elektrode til å registrere strømene som oppstår over membranen. Hvis nevrofysiologer vil vite om strømmen av elektriske strømmer gjennom spesifikke områder av a nervecelle membran, de bruker patch clamp teknikken. For å gjøre dette bruker de en fin glasspipette som er plassert på utsiden av cellen. Negativt trykk kan opprettes ved å suge det ved hjelp av en injeksjonssprøyte. Denne prosedyren får membranen til å bule litt på det tilsvarende stedet. Undertrykket sørger for at glasset festes til membranen. Dette resulterer i elektrisk isolasjon av den lille membranflekken i pipetten fra resten av membranen. For å måle de elektriske strømningene, bruker nevrofysiologene en patch clamp forsterker. Dette er et spesielt måleinstrument. I det ideelle tilfellet kan forskeren bruke enheten til å innhente informasjon om de elektriske egenskapene til de enkelte ionekanalene. Ionkanalene regulerer for eksempel inn- og utstrømning av natrium ioner, som er positivt ladede, i nervecellene. Undersøkelsen foregår på cellene til mennesker, planter eller dyr. Patch-clamp-metoden utføres vanligvis på en målestasjon som inkluderer forskjellige enheter. På det vibrasjonsdempede målebordet er det et såkalt Faraday-bur, som fungerer som et elektrisk skjold. Videre er et optisk mikroskop inkludert en mikromanipulator tilgjengelig for å bringe patchpipetten i posisjon. I tillegg har pipetteholderen en forbindelse til en forforsterker, mens prøveholderen er koblet til en badelektrode. Patchklemforsterkeren fungerer for å forsterke forforsterkerens signal. Det er også levert en skjerm for å observere DUT samt patch pipette. I de fleste tilfeller er en datamaskin og flere datalagringsenheter også tilgjengelig ved målebordet for å muliggjøre digital opptak.
Risiko, bivirkninger og farer
Det er ingen risiko forbundet med patch-clamp-teknikken. For eksempel blir celler fra mennesker, dyr eller planter ikke undersøkt før etter at de er fjernet. Ubegrenset tilgang til den ytre cellemembranen eksisterer sjelden. Av denne grunn er det ofte nødvendig å forberede cellene for patch-clamp-metoden. Etter å ha fylt patch-pipetten, blir den klemt fast i en mikromanipulator. Denne er koblet til patch-klemforsterkeren og presset forsiktig på en celle som er intakt. Prosessen kan følges med en monitor eller et mikroskop. Under pipetten sitter et stykke membran som kalles en membranplaster. Det svake undertrykket som er opprettet i bakenden av pipetten, gir en sterk forbindelse mellom pipetten og membranen. Denne prosessen resulterer i dannelsen av en elektrisk motstand mellom den eksterne løsningen og pipettens indre av flere gigaohms. Forskere refererer også til dette som "gigaseal", som gjør det mulig å oppnå den cellefestede konfigurasjonen av patch-clamp-metoden. Strømmen som strømmer gjennom en ionekanal i plasteret strømmer også gjennom innholdet i pipetten på grunn av den høye gigaseal-motstanden. En elektrode koblet til forsterkeren er nedsenket i løsningen av pipetten, slik at aktivitetene til individuelle ionekanaler i patchmembranen kan måles.
